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ChromoTek 常见问题解答
乐博生物 / 2012-07-11
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1、GFP-Trap®可识别的GFP衍生物类型有哪些?

    (1) eGFP, wtGFP, GFP S65T

(2) TagGFP

(3) eYFP, YFP, Venus, Citrin

(4) CFP

不能识别:TurboGFP所有的RFPs

 

2、RFP-Trap®可识别的RFP衍生物类型有哪些?

(1) mRFP

(2) mCherry

(3) mOrange

(4) mPlum

(5) mRuby

(6) mKate2

    不能识别:DsRedmRFPrubyTagRFP、所有GFPs

 

3、Nano-Trap® (GFP-Trap® / RFP-Trap®的结合能力如何?

    Nano-Trap®的结合能力取决于珠子。每10μL浆液,琼脂糖珠可结合2~3μg GFP,磁性颗粒可结合0.25-~0.5μg GFP。

 

4、可以从GFP-Trap洗脱结合蛋白么?

    关于定量洗脱,可以将样品至于SDS上样缓冲液中95℃煮10min(详见protocol),或者在0.2 M的甘氨酸(pH2.5)中孵化0.5~2min,随后用0.1体积的1M Tris碱中和。


5、是否可以从GFP-Trap洗脱出自然状态的结合蛋白,比如,在凝胶迁移实验或功能分析实验中?

    可以尝试洗脱游离的GFP。但是,请注意,这种方法,不能定量洗脱出目标融合蛋白。

 

6、怎样才能避免非特异性的蛋白与GFP-Trap交互作用而结合?

    关键操作步骤,是在孵化液中稀释洗涤剂的浓度。我们建议,洗涤剂为终浓度0.1%(如NP-40 TX-100),且最终体积不少于0.4mL。另外,我们建议,要测定各种洗涤缓冲液的盐浓度,使其范围在150mM-500mM范围内,以去除非特异性结合的亲水性蛋白。


7、在binding过程中,N-端与C-GFP融合蛋白之间是否存在差异?

    GFP-Trap®C-末端的GFP融合蛋白的亲和力稍高,若要消除这种差异,可以加长孵化时间(1-2h取代15-30min

 

8、是否可以在组织样品(即变性缓冲液)中直接纯化GFP标记的融合蛋白?

    原则上,GFP-Trap®即使在恶劣的缓冲条件下(如,RIPA缓冲液,含0.1%SDS1M尿素),也非常稳定。

 

9、可结合的GFP-Trap®珠的GFP结构,是否有大小限制?

    无。

 

10、如果在洗脱液中,有剩余的背景怎么办?

    建议使用Chromotekblocked particlesbab-20 or bmp-20)对样品进行预处理。

 

 

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