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Cytoskeleton公司罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin,货号PHDR1)现货促销!
lebo / 2015-09-18
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Cytoskeleton公司罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin,货号PHDR1)现货促销!

 

产品名称:Rhodamine phalloidin 罗丹明标记的鬼笔环肽

产品货号:PHDR1

 

 

 

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背景描述:

 

鬼笔环肽是一种从鬼笔鹅膏中得到的有毒的环状七肽,可以与纤维肌动蛋白丝非常特异的结合,并且具有很高的亲和力。它能使肌动蛋白聚合物的临界浓度降低到小于1µg/mL,因此,常作为一种聚合促进剂使用。该物质可以被罗丹明染料标记,从而作为肌动蛋白抗体替代物广泛用于组织细胞培养、组织切片或无细胞系中的肌动蛋白标记。被罗丹明标记的肌动蛋白丝其生物学特性未发生改变(包括与肌球蛋白结合的能力)。

罗丹明标记的鬼笔环肽呈粉色,固体,分子量1306。其1 x 工作液即可对300-350张盖玻片的细胞进行染色。

注意:鬼笔环肽具有毒性,需小心操作(对人,其半数致死剂量为2mg/Kg)。

 

运输与保存方法:

室温运输。使用前简短离心使样品至管底,加入500µl无水甲醇配制成14um的溶液。推荐将其溶液分装成10×50µl份于-20℃避光保存,按照这种方法可稳定保存6个月,冻干产物可以在4℃干燥环境(湿度<10%)下保存1年。

 

产品应用:

应用1:免疫荧光

目前有多种方法可用于组织培养细胞中的微丝染色,而染色过程中固定是获得良好效果的关键步骤,根据不同的要求有不同的固定方法。用多聚甲醛或者戊二醛的方法固定可以取得较好的染色效果。

试剂

1)     罗丹明标记的鬼笔环肽;

2)     半丰度的3T3培养细胞;

3)     F-肌动蛋白染色试剂盒(或按4-7配制溶液);

4)     磷酸盐缓冲液(20mM,PH7.4,150mM NaCl);

5)     固定液(3.7% 多聚甲醛溶于PBSpH调制7.0);

6)     透化液;

7)     抗荧光淬灭封片液(Fluka Biohemika, Cat.#10981;

8)     100nM DAPI(溶于PBS;

9)     载玻片;

10)  盖玻片封口液。

1 经罗丹明鬼笔环肽标记的Swiss 3T3细胞中应力纤维图

备注:按照方法中的步骤利用Rhodamine phalloidin对生长于玻璃盖玻片上的半丰度的3T3细胞进行染色,利用带有480Ex/535Em设备的荧光显微镜进行观察(CCD摄像机,40倍目镜),明显可见被罗丹明鬼笔环肽染成红色的纤维蛋白丝和被DAPI染成蓝色的细胞核。

设备

1)荧光显微镜。

2)数字CCD照相机。

方法

1)     于盖玻片上培养组织细胞至半丰度;

2)   100nM Rhodamine phalloidin工作液的准备,即吸取3.5µl 14µM Rhodamine phalloidin的标记储存液于500µl PBS,室温避光保存。

3)     移除培养基,37℃下利用PBS轻轻洗涤培养细胞一次;

4)     利用固定液室温固定细胞10min

5)     PBS室温洗涤细胞30s

6)     室温透化细胞5min

7)     PBS室温洗涤细胞30s

8)   将盖玻片移至一张封口膜上,于潮湿的环境下加入200µl 100nM Rhodamine phalloidin,室温避光孵育30min

9)     PBS洗涤盖玻片3次;

10)  200µl 100nM DAPI复染DNA30s

11)  PBS冲洗盖玻片,翻转将其放置于滴有荧光猝灭液的载玻片上,用纸巾吸除多余液体;

12)  4 ℃避光保存上述载玻片;

13)  典型的F-肌动蛋白染色结果如图1

应用2:稳定荧光微丝的制备

在肌球蛋白马达蛋白的研究中,稳定的微丝对于肌动蛋白的能动性分析是一个很好的底物。Rhodamine phalloidin的结合不会影响肌球蛋白ATP酶对肌动蛋白的激活作用。


试剂

1)     肌动蛋白(250µg);

2)     常用肌动蛋白缓冲液(5mM Tris-HCl pH8.0, 0.2mM CaCl2)

3)     10 x聚合缓冲液(100mM Tris pH7.5, 500mM KCl, 20mM MgCl2,10mM ATP;Cat.#BSA02)

4)     罗丹明标记的鬼笔环肽。

设备

荧光显微镜;数字化CCD照相机。

方法

1)   配制具有0.2mM ATP 1.0mM DTT的肌动蛋白缓冲液,取250µl重悬兔肌肉肌动蛋白。混匀,冰浴1h

2)         加入1/10体积的聚合缓冲液室温聚合肌动蛋白1h

3)   2.5µl 14uM Rhodamine phalloidin500µl聚合缓冲液中,混匀,利用该溶液100倍稀释聚合的微丝;

4)   1滴抗荧光猝封液于载玻片上,吸取1µl标记的肌动蛋白于上述抗荧光猝灭封片液中;

5)     盖上盖玻片,吸除多余液体;

6)     显微镜观察,微丝呈2-10µm的长度,4℃避光可以稳定保存一周。

产用使用

1)用于固定的组织切片、组织培养细胞中微丝的荧光染色。注意:不像一些肌动蛋白抗体,Rhodamine phalloidin仅与F肌动蛋白丝结合,从而降低了荧光背景。另外,该染料的结合没有物种差异。

2)体外稳定的荧光微丝的制备。

参考文献

1. Wµlf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.

2. Kron, S.J. et al. (1991). Meth. Enzmol. 196: 399-416.

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